2022年冬至2023年早春以来，广东茂名罗非鱼主养区陆续出现不明原因死亡，养殖户使用多种药物均无明显疗效。为了明确病因，湖南渔美康生物技术集团股份有限公司组织四川农业大学汪开毓教授一行，深入养殖一线开展疾病诊断和调研工作。
通过广泛走访、现场采样、观察、剖解发现，不同规格的罗非鱼均可感染发病，体重50g至2000g左右的规格均可发生。病鱼体表症状不典型，大多数没有明显可见的肉眼病变，少数可见大小不等的浅表皮肤溃疡，或下颌等处灶状充出血，眼虹膜充血发红（图1 A-B），偶可在皮肤上见白色结节。剖解发现，鳃丝有少量异物附着，腹腔内可见多少不等的腹水；可在脾脏、肾脏、肝脏、心脏、肠道等多处器官发现广泛、多灶性、粟粒样白色结节样变（图1 C），其中脾脏和肾脏结节最多、最为典型，而肝脏、心脏和肠道偶见。此外，还可见肝脏肿大发黄，有的可见绿肝；胆囊极度扩张，剖解时极易破损，胆汁深墨绿色；消化道无食物，充满大量淡黄色粘液；偶可见脑膜充血。
图1，患病罗非鱼大体病理观察
A.病鱼皮肤溃烂；B.虹膜充出血；C.胆囊极度扩张，脾脏可见弥漫性大小不等的粟粒状白色结节
为了明确可能的病因，尽可能挖掘更多信息，现场开展了组织触片和血液涂片检查。Diff-Quik快速染色后显微镜下观察发现，组织和血液中巨噬细胞数量明显增多，胞浆极度扩张，其内可见近球形或椭圆形、单个或双个存在的蓝染的细菌样病原（图2 A-B），根据其形态及感染特征，初步怀疑为立克次氏体感染。
图2，血液涂片检测
A.可见大量巨噬细胞，胞浆极度扩张，胞核被挤于一侧；B.为A图红框部分放大图。胞浆内可见大量近球形或椭圆形、单个或双个存在的蓝染立克次氏体样病原（Diff-Quik染色）
为了进一步明确各组织的病变特点及准确鉴定致病病原，现场用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定病变明显的组织，并采集新鲜样品带回实验室进一步开展细胞培养及分子生物学检测。组织病理学检测发现，脾脏、头肾中可见弥漫性灶性病变（图3 A），放大后可见小血管广泛性血管炎，血管内皮肿胀、坏死、脱落，腔内偶可见微血栓，血管平滑肌细胞不同程度肿胀，胞核变圆，血管周围被大量巨噬细胞包绕，形成管套状结构，巨噬细胞外可见1-2层由成纤维细胞包绕形成的包膜，巨噬细胞可从血管管腔和血管外周两个方向侵入血管壁，可在血管壁内平滑肌细胞间发现数量不等的侵入的巨噬细胞；随着病变进一步恶化，病变范围以血管为中心进一步扩大，血管结构完全消失，被大量巨噬细胞及坏死的细胞碎片填充，甚至坏死、腐离脱落，中心形成巨大的空洞，坏死灶周围由大量的上皮样细胞和成纤维细胞包绕，形成肉芽肿样病变。肝脏可见小灶性坏死，坏死灶内肝细胞变圆、体积缩小、深染，在部分血管周围及汇管区周围，可见大量巨噬细胞浸润，同时可见胰腺组织周围水肿，与周边肝实质间隙增宽，并伴随胰腺细胞变性坏死。心外膜明显增厚，大量巨噬细胞浸润，可见中度心外膜炎。鳃可见少量动脉瘤样变。
电镜检测结果发现，肉芽肿内可见数量不等的立克次氏体样病原（图4）。利用立克次氏体专用引物进行PCR扩增，电泳结果表明，脾脏、头肾组织样本立克次氏体检测为阳性，目的片段为476 bp（图5），测序后NCBI数据库比对表明，扩增的基因序列与立克次氏体同源性最高。此外，将新鲜组织样本接种EPC细胞，可在3天左右出现明显的细胞病变，培养物经PCR检测及产物测序亦发现立克次氏体感染。
图3，患病罗非鱼组织病理学观察
A.脾脏弥漫性多灶性血管炎；B.受损血管内皮细胞坏死脱落，管壁平滑肌细胞肿胀、变圆，血管外周可见大量巨噬细胞将血管包裹，形成管套样结构，血管壁内亦可见大量浸润的巨噬细胞，管腔内可见微血栓
图4，罗非鱼头肾巨噬细胞胞浆内立克次氏体样病原
A.中肾巨噬细胞；B.为A图的放大图，示立克次氏体样病原（箭头所示）
图5，PCR检测
M：DNA marker；1.头肾；2.脾脏
综上检测结果表明，引起本次广东茂名罗非鱼大面积发病的原因为：立克次氏体类病原感染导致的，以脾脏和头肾为主要病变靶器官的全身多脏器广泛性坏死性血管炎，但其致病病原具体是哪一种立克次氏体感染，还需要后续进一步深入研究，相关工作也在持续开展之中。
立克次氏体是一类严格胞内寄生的原核细胞型微生物，为多形性革兰氏阴性菌，直径约0.5-1.5μm，可引起人、畜及鱼感染发病。已有报道发现银鲑、大西洋鲑、海鲈、石斑鱼、真鲷等十几种经济鱼类均可感染，导致巨大的经济损失。虽然实验室药敏发现多种药物均有敏感性，然而由于其胞内寄生的特点，许多药物不能穿透细胞膜而到达细菌靶点，大大降低了在体药物疗效，故综合防控是降低该病发病死亡的主要途径。根据该病的特点，作者提供以下防控建议：
1.预防：放苗前彻底清塘和消毒。苗种需经专业机构检测阴性方可购买，避免立克次氏体从苗种端带入。合理养殖密度，重视水质和底质的定期调节，在疾病发生季节增加益生菌等水质底质调节频率，每周2次以上。此外，重视鱼体抵抗力的提高，不定期饲喂免疫增强剂，发病季节可在饲料中长期添加。
2.治疗：
①发病期间养殖管理：及时捞出发病鱼，减少传播源；增加巡塘，及时掌握病程进展；增加水体溶氧，减少应激。
②内服：强力霉素、氟苯尼考、无花果多糖、多维，根据推荐剂量拌料内服，7天一个疗程，连用2-4个疗程。
③外用：
消毒方案：聚维酮碘等温和消毒剂，每天1次，连用1-2次；
调水方案：芽孢杆菌、EM菌、光合细菌等活菌制剂，每2-3天一次，可根据情况增加使用次数；
改底方案：以具有增氧改底效果的底质改良剂为主，可与调水方案联合使用或间隔使用。
（学校新闻报道链接：https://news.sicau.edu.cn/info/1133/72170.htm）
